При изучении действия токсических веществ (пестицидов, производственных сточных вод и т. д.) на рыб применяется большое количество критериев различной степени чувствительности от «рыбной пробы», т. е. определения выживаемости до современных методов исследования на молекулярном уровне.
При оценке методик, применяемых для решения задач водной токсикологии, Строгановым (1960 и др.) неоднократно отмечалась необходимость применять критерии, обеспечивающие биологическую и хозяйственную нормы для основных гидробионтов, полезных человеку, для чего следует определять выживаемость, размножение и плодовитость, качество потомства. Это подтверждено и нашими работами по изучению длительного влияния некоторых альгицидов на развитие, плодовитость и качество потомства рыб.
Как следовало ожидать, введенные в среду обитания некоторые альгициды в концентрациях в десятки раз меньших летальных, при длительном воздействии могут существенно влиять на указанные выше показатели (Чернышева, 1968). Такое действие токсических веществ может приводить к уменьшению скорости роста и численности рыб, а следовательно, отражаться на рыбной продуктивности водоема.
Поэтому мы совершенно согласны с точкой зрения Строганова, что основными показателями при оценке влияния токсических веществ и определении ПДК для рыб являются рост, развитие, плодовитость и качество потомства.
Одним из решающих моментов при оценке действия токсических веществ является выбор объекта, на котором можно проводить испытания. При испытании токсических веществ на промысловых рыбах возникает ряд трудностей, заключающихся в том, что для проведения опытов необходимо иметь хорошо оборудованные экспериментальные базы, обеспечивающие условия для нормального роста, развития и размножения подопытных рыб. Кроме того, проведение таких работ на промысловых рыбах требует много времени, так как большинство из них медленно растут и созревают. Длительное половое созревание заставит проводить трудоемкие морфологические исследования по определению изменений в развитии половых продуктов под действием токсических веществ. Отсутствие ясно выраженных вторичных половых признаков у большинства промысловых рыб затрудняет определение скорости половой дифференцировки. Все это говорит о том, что определение действия токсических веществ на промысловых рыбах займет много времени, потребует много труда и средств.
Предпринятые нами поиски удобного для исследований объекта заставили остановиться на аквариумной рыбке гуппи Lebistes reticulatus. Положительными свойствами гуппи являются ее малые размеры, неприхотливость к условиям обитания, короткий цикл развития, рано появляющиеся и четко выраженные вторичные половые признаки, почти 100%-ная выживаемость мальков в обычных аквариальных условиях, легкость разведения и кормления, а также возможность получения массового количества однородного подопытного материала в течение всего года. Все это делает гуппи чрезвычайно удобным объектом для исследования. Общеизвестно (Ильин, 1965; Sterba, 1955 и др.), что гуппи хорошо растут и размножаются в аквариумах, создать для них оптимальные условия для роста и размножения не представляет трудностей, этого можно достигнуть в любой лаборатории. Кажущимся отрицательным качеством гуппи является то, что они по сравнению с другими рыбами проявляют большую устойчивость к токсическим веществам. Однако эту большую устойчивость гуппи можно связать с тем, что они при испытании находятся в оптимальных условиях, в то время как другие рыбы, выловленные из водоемов и помещенные в экспериментальные условия, находятся в состоянии «стресса», при котором токсичность будет проявляться в значительно большей степени. Как пример влияния содержания в неблагоприятных условиях можно привести данные Кийера и соавторов (Quilleir, Marti, Capmartin, Secondat, 1965), которые показали, что содержание гуппи в аквариумах без растений уже приводит к нарушениям у них сперматогенеза и задержке развития гоноподия.
Совершенно очевидно, что многие вопросы водной токсикологии успешно могут решаться при работе на гуппи (изучение механизма действия токсических веществ, определение летальных дозировок, изучение влияния токсических веществ на рост, созревание, развитие, размножение, плодовитость, качество потомства, а также цитоморфологического изменения внутренних органов и др.).
Данные, полученные на гуппи, вполне могут быть использованы и до некоторой степени перенесены на промысловых рыб. Естественно, что для того или иного вида рыб, в связи с их большей или меньшей чувствительностью к различным токсическим веществам, потребуется уточнение токсических концентраций. Подтверждением этому служит опыт медицинской и промышленной токсикологии, где испытания проводятся, как правило, на лабораторных животных. Живородящая рыбка гуппи является обитателем тропиков. Несмотря на это гуппи выдерживают значительные колебания температуры, однако размножение их возможно при температуре не ниже 18–20° С. Оптимальной температурой для них является 22–24° С. Самки гуппи достигают половозрелости в возрасте 180–200 дней и в дальнейшем в зависимости от условий содержания и кормления мечут мальков через каждые 28–35 дней. Впервые созревающие самки при нормальных условиях содержания мечут от 10 до 20 мальков. С каждым последующим пометом плодовитость самок увеличивается и может достигать до 80 экз. за один помет.
Работу по испытанию токсических веществ лучше проводить, на рыбах одной линии. Это снизит индивидуальную изменчивость которая у гуппи может достигать значительных величин. Получить стадо производителей гуппи не представляет трудностей. Для этого вначале нужно иметь крупную половозрелую самку и двух-трех самцов. Эти производители при хороших условиях содержания и кормления, достигнув через 180–200 дней половозрелости, уже могут обеспечить целое поколение.
Для проведения опытов на гуппи по испытанию токсических веществ лучше иметь стеклянные аквариумы. Обычные каркасные аквариумы применять не рекомендуется, так как металл каркаса может окисляться и влиять на качество воды, а также реагировать с вводимыми для испытания препаратами.
Дно аквариума должно быть засыпано песком. Лучше всего брать речной хорошо промытый песок без примесей глины, которая может давать трудно устранимую муть. Песок насыпается, в зависимости от объема аквариума, слоем от 2,5 до 8,0 см. Для опытов можно использовать воду из водопровода, но лучше ее брать из природного водоема. Вода из водопровода перед залитием в аквариумы должна быть хорошо отстояна, а при выпадении осадка профильтрована через гигроскопическую вату. В аквариумы помещаются высшие водные растения. Хорошо растут в аквариумах валлиснерия, людвигия, амбулея, элодея, риччия, роголистник, уруть и др. Аквариумы приготовляются за 5–7 дней (а если возможно и больше) до постановки опыта. Это нужно для того, чтобы растения укоренились и окрепли, а вода отстоялась.
Общеизвестно, что действие токсических веществ находится в прямой зависимости от температуры, поэтому опыты рекомендуется проводить при определенной постоянной температуре. Это также будет способствовать сравнимости результатов опытов, проведенных по определению токсичности различных препаратов разными исследователями, и позволит дать сравнимые результаты. Температуру в опытах можно регулировать при помощи контактных термометров и реле. Нами опыты проводятся в термостатированных шкафах с подогревом, где температура регулируется двухпозиционным дистанционным терморегулятором (ТТД) львовского завода «Теплоконтроль».
При работе с гуппи, как представителем тропической фауны, оптимальным является освещение в течение 12 час. Автоматическое регулирование светового режима также достигается при помощи приборов. Нами с успехом используется «программное реле времени» типа 2РВМ, выпускаемое ленинградским заводом электрических часов. В случае отсутствия приборов для регулирования температуры и освещения опытные и контрольные серии следует проводить в сходных условиях, однако это намного будет уменьшать ценность полученных данных.
В опытах необходимо учитывать жесткость воды, что имеет большое значение при определении токсичности. При проведении опытов необходимо наблюдать за состоянием растений, проверять кислородный режим, рН и СО2, а также проводить контроль за скоростью разложения токсического вещества. Все это необходимо потому, что действие токсического вещества складывается из прямого токсического действия и косвенного за счет неблагоприятных изменений в водоеме, которые оно вызывает.
При соблюдении указанных условий на гуппи можно проводить испытание токсических веществ по различным показателям. Ниже приводятся примерные схемы постановки опытов по некоторым из них.
В опыты берутся мальки 1–2-дневного возраста. Чтобы максимально исключить индивидуальные вариации плодовитости, мальки берутся от возможно меньшего числа самок (не больше 2—3) и равномерно распределяются по сериям. Опыты по определению плодовитости рекомендуется проводить на 40–50 мальках в каждой серии. Посадка мальков не должна превышать 3–4 экз. на 1 л воды.
Контрольная и опытная серии в отношении температуры, света, корма, объема аквариумов, плотности посадки, качества воды, количества растений, должны находиться в максимально сходных условиях.
Подопытные мальки выращиваются до половозрелости. Близких к зрелости самок (что определяется по наполнению» брюшка и появлению темноокрашенной массы в брюшной полости) надо высаживать для выметывания мальков в отдельные сосуды (воду берут из опытного сосуда). Самки гуппи очень, часто поедают только что отметанное потомство, поэтому за. этим нужно строго следить. Для того чтобы мальки могли прятаться, в сосуды помещают растения. Удобными для этого являются роголистник, элодея, риччия, нитчатые водоросли. В случае если самка особо агрессивна мальков необходимо отсаживать по мере их выметывания. Отметавших самок возвращают обратно в аквариум для повторного созревания.
Расчет плодовитости самок гуппи проводится за период времени, когда все самки в контроле созреют. При расчетах средняя плодовитость самок в контрольной серии принимается: за 100%. Учитывают время, за которое созревают самки в контрольной и опытной сериях, количество созревших самок, число повторно отнерестившихся самок и их плодовитость, среднее количество отметанных мальков в расчете на одну самку и на один помет, а также среднее количество потомства в расчете: на одного посаженного в опыт малька.
При оценке токсического действия препарата скорость развития половых продуктов имеет большое значение. Так, например, время появления вторичных половых признаков у самцов гуппи, т. е. наступление половой дифференцировки, под влиянием токсических веществ может замедляться или, в случае стимулирующего эффекта, происходить скорее, чем в норме. Кроме того, могут наблюдаться изменения в соотношении самцов и самок. Появление вторичных половых признаков у самцов гуппи происходит в среднем в течение 40–50 дней и в значительной степени зависит от условий содержания. Они выражаются в изменении лучей анального плавника и формировании из них гоноподия, а также в появлении характерной окраски и изменении хвостового и спинного плавников.
При изучении токсических веществ на скорость развития в контрольную и опытную серии следует брать мальков от одной самки. Количество мальков в серии должно быть не менее 10–15 экз. Наблюдения за появлением изменений в анальном плавнике и образованием гоноподия нужно начинать уже с 35-дневного возраста. В опытных сериях фиксируются начало образования гоноподия, изменения хвостового и спинного плавников и появление окраски. При систематических просмотрах отмечается количество рыб, имеющих эти признаки. Просмотр рыб необходимо проводить не реже одного раза в 5 дней. Фиксируются также срок, когда наступил конец половой дифференцировки у всех рыб, и количество самцов и самок. По разнице в скорости развития контрольных и опытных рыб можно судить о степени и характере влияния токсического вещества на процессы половой дифференцировки. Для более точного суждения о характере отклонений от нормы развития необходимо в конце опыта проводить гистологический контроль.
Только что отметавших самок гуппи помещают в отдельные сосуды и определяют скорость их созревания и плодовитость. Затем их вместе с самцами помещают в аквариумы, в растворы токсических веществ. Созревших самок высаживают в отдельные аквариумы для нереста. Сравнивая плодовитость и срок созревания контрольных и подопытных самок можно судить о действии токсического вещества. Такие опыты должны проводиться при достаточном количестве повторностей (не менее 10 самок). Контрольная и опытные серии в отношении условий содержания должны проводиться в максимально сходных условиях содержания.
Опыты можно проводить как на половозрелых самках, выросших в нормальных условиях, так и на самках, выросших и созревших в растворах токсического вещества. Выметанные такими самками мальки помещаются в аквариумы с чистой водой. За время опыта проверяют показатели их роста, развития, а также плодовитость и сравнивают с контрольными рыбами. Контролем к этим опытам являются мальки, выметанные самками, созревшими в нормальных условиях. Опыты должны проводиться при достаточном количестве повторностей (не менее 10 самок в каждой серии) и в сходных условиях.
Для этих опытов необходимо использовать самок с возможно большей плодовитостью. Мальки, полученные от одной самки, выращиваются в аквариумах с растворами испытываемых токсических веществ и в аквариумах с чистой водой. Проводится периодическое взвешивание мальков на торзионных весах. Затем мальки высушиваются до постоянного веса (в сушильных шкафах при 70°) и взвешиваются на аналитических весах. О влиянии токсического вещества на рост судят по показателям веса и соотношению сухого и живого весов. Опыты должны проводиться не менее чем при пяти повторностях. Опыты должны проводиться в сходных условиях.
При изучении влияния токсических веществ на организм необходимо учитывать насколько действие токсического вещества обратимо (в зависимости от концентрации срока действия). В результате постановки опытов по переводу подопытных рыб из растворов токсического вещества в чистую воду можно определить срок, в течение которого определенная концентрация вещества не будет вызывать в организме необратимых патологических изменений.
Определение обратимости может иметь большое значение при разработке методик введения в водоемы токсических веществ, так, например, при введении альгицидов с целью подавления избыточного развития синезеленых водорослей. Изучение обратимости может иметь большое значение также при определении ПДК и степени очистки сточных вод.
Критериями обратимости патологических изменений под действием токсических веществ может быть выживаемость подопытных животных, их рост, плодовитость, качество потомства, а также физиологические, биохимические, цитологические и другие показатели.
Опыты в зависимости от выбранного критерия, проводятся по вышеприведенным схемам. После определенного срока действия токсического вещества подопытные рыбы переводятся в аквариумы с чистой водой. Приближение показателей к контрольной серии будет свидетельствовать об обратимости патологических изменений, отсутствие изменений в показателях будет свидетельствовать о необратимом действии токсического вещества.
Приведенный перечень вопросов, разрешение которых возможно при работе на гуппи, не является исчерпывающим. По существу на этой рыбе могут проводиться любые исследования, связанные с изучением влияния токсических веществ на организм рыбы.